我们先后采用鼠源化CD19-CART、人源化CD20-CART、人源化CD22-CART细胞成功治疗了1例晚期弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）,她的淋巴瘤细胞有复杂染色体异常及TP53等基因突变，且血液乙肝病毒基因载量高，CART治疗至今很好生存近2年。通过这例患者的诊治我们获得以下经验教训：

CART细胞是治疗难治复发DLBCL(rr-DLBCL)非常有效的方法，即使带有预后很不好的染色体和基因，也可以达到完全缓解。我们团队有丰富的治疗经验使CART治疗过程相对安全（比难治复发急性白血病更安全）。建议患者一线治疗方案无效及时换用CART治疗，避免过多化疗导致更多的染色体异常及基因变异，使疾病更为难治。

由于同一患者肿瘤细胞的抗原表达不一样，仅使用一种靶点的CART很难治愈或者使患者长期生存，而使用多种靶点的CART治疗可以明显延长持续完全缓解时间，多靶点CART治疗是否可以治愈患者尚有待长期更多患者的观察。

CART治疗的并发症的严重程度与体内肿瘤负荷有关，体内肿瘤负荷低的患者，CART治疗的并发症很少。

对血液HBV-DNA载量高或者合并感染的患者，在强有力抗病毒复制或抗感染的条件下，采用CART治疗是安全的。

对伴有复杂染色体异常、TP53等基因突变的患者，三种靶点的CART治疗能否治愈，是否需要用靶向药物维持尚有待进一步观察。

DLBCL是成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)最常见的病理类型,其发病率约占NHL的30～40%。标准的治疗方案是CD20单抗联合化疗（又称为免疫化疗），治愈率50-70%。但是仍有30-50%的对目前的免疫化疗耐药，复发难治，这类患者预后差，即使尝试二、三线化疗联合放疗、靶向治疗甚至自体/异基因造血干细胞移植等，其2年总生存期（OS）仅约20%，很难长期生存。且长期反复大剂量化疗、放疗或造血干细胞移植常常使得患者长期住院、严重影响患者的生存质量。

CD19抗原特异性嵌合性抗原受体T细胞（CD19-CART）治疗rrDLBCL的疗效已经获得证实，被美国药品食品管理局(FDA)正式批准治疗rrDLBCL。但是国际报告仅用19-CART治疗rrDLBCL的完全缓解率(CR)仅50%左右，由于肿瘤细胞异质性问题（同一患者不同肿瘤细胞不一样性），仅用19-CART治疗，即使获得CR，多数患者仍会复发。已经有较多临床数据证实CD22-CART、CD20-CART细胞治疗复发难治B细胞肿瘤也有效，且极大部分风险可控，因此我们设计了序贯采用多种B细胞靶抗原的CART治疗难治复发性B细胞肿瘤，以克服单一靶点治疗不能覆盖全部肿瘤，或完全缓解后靶抗原阴性的复发问题，从而提高CR率，延长持续完全缓解时间,甚至达到治愈。

现将多种靶点CART细胞序贯治疗一例伴TP53基因变异、复杂染色体异常、携带高乙肝病毒基因载量、巨脾、骨髓累及的老年女性rrDLBCL患者的过程报告如下。

一、来我院前外院诊治过程

患者，女性，54岁，年08月发现右侧耳后淋巴结肿大，后发医院。查血红蛋白（HGB）61g/L，血小板（PLT）76×/L；骨髓细胞形态学检查发现异常淋巴细胞；流式细胞免疫分型发现异常B细胞占有核细胞42.6%，表达CD45dim、CD19、CD20、CD22、HLA-DR、cCD79a；染色体：81（4n），XXXX，-1，-1，del（1）（p36.1）×2，del（20）（q11.2），de（?）t（1:?（p13:?）×2。B超示脾大并脾静脉扩张，腹腔腹膜后淋巴结大，双颈部、双腋窝、双腹股沟淋巴结肿大，均边界尚清。PET-CT示：1、全身多发FDG代谢增高淋巴结，多发骨髓腔内FDG代谢增高，脾大，符合非霍奇金淋巴瘤，病变累及膈上下多个区域；2、盆腔少量积液；3、脊柱退行性病变。切除右腹股沟淋巴结行病理检查考虑弥漫性大B细胞淋巴瘤，非生发中心来源可能性大；淋巴结正常结构消失，可见弥漫增生的淋巴样细胞，细胞大，可见核仁，细胞浆透明，免疫组化示：CD20（+），CD79a（+），CD3（-），CK（-），CD10（-），CD21（FDC+），CyclinD1（-），c-myc（-），Bcl-6（-），MUM1（+），PAX-5（+），bcl-2（+），CD23（FDC+），CD5（弱+），CD38（-），KI-67（50%+）；原位杂交：EBER（-）。

患者母亲同胞多位携带乙型病毒；患者母亲患“肺癌”去世

诊断后按DLBCL用R-CHOP（美罗华、环磷酰胺、脂质体阿霉素、长春地辛、泼尼松或地塞米松）治疗4疗程后PET-CT及骨髓检查达部分缓解（PR),为原发耐药的rrDLBCL。故改为R-DA-EPOCH(美罗华、依托泊苷、环磷酰胺、脂质体阿霉素、西艾克（长春地辛）、地塞米松)化疗2疗程。.5月颈部淋巴结再次肿大，予以依鲁替尼、雷利度胺治疗4个月，前3个月肿块有所缩小，后一个月不再缩小故年10月16日来我院诊治。

二、首次入我院后诊治

1.入院时检查

1）一般状态差，ECOG评分2分。查体：中度贫血貌，双侧颈部可扪及多枚淋巴结肿大,大者直径约3.5CM，质地硬，边界不清，固定，无压痛；脾巨大：甲丙线13CM，丁戊线7CM，触诊饱满，质地硬，无压痛。血常规：WBC1.42×/L，HGB65g/L，PLT59×/L；血LDH.80U/L；乙肝病毒DNA（HBVDNA）定量7.×IU/ml。

2）骨髓形态示增生活跃，异常淋巴细胞占14%；流式细胞免疫分析见22.35%的单克隆异常表型成熟B细胞，强表达CD19、22，表达CD20，考虑DLBCL可能大；43种血液肿瘤融合基因筛查阴性；血液肿瘤基因突变筛查发现TP53、NOTCH2基因变异；染色体为复杂染色体异常：72～76〈3n〉，XXX，-1，del（1）（p36）×2，+3，del（3）（p21）×2，-5，+6，+9，+10，+12，add（16）（q12），+18，+3mar，inc[cp5]/46，XX[15]；FISH示BCL2、BCL6、MYC基因扩增，可能与染色体数目改变有关。

骨髓细胞形态：

骨髓流式细胞免疫分型：可见22.35%的异常表型成熟B细胞。

骨髓基因突变筛查：

骨髓染色体：72～76〈3n〉，XXX，-1，del（1）（p36）×2，+3，del（3）（p21）×2，-5，+6，+9，+10，+12，add（16）（q12），+18，+3mar，inc[cp5]/46，XX[15]。

骨髓FISH检查：BCL2、BCL6、MYC基因扩增，可能与染色体数目改变有关。

3）影像学检查：

全身浅表淋巴结彩超结果示：双侧颈部、锁骨下淋巴结肿大髓质结构消失；右侧腋窝、双侧腹股沟淋巴结可见。腹部B超：脾脏弥漫性肿大，形态失常，脾门切迹消失，仰卧位脾脏下极超过脐水平，周围脏器受压移位，厚约11.1cm；肝稍大。

心电图结果示：窦性心律2.T.V4～V6改变3.ST～T.Ⅱ.Ⅲ.aVF.改变。动态心电图结果示：窦性心律：ST-T改变。

胸部CT检查结果示：1、双肺感染。双侧胸膜增厚粘连；2、纵隔多发淋巴结肿大；3、脾大。

头部MRI检查示：1、双侧额顶叶缺血灶；2、双侧眼眶外下壁明显增厚，请结合临床。3、双侧中耳乳突炎。

2.初次入院治疗经过

由于患者既往多次化疗及靶向治疗效果不佳，伴有TP53基因变异及复杂染色体异常（其中有-5异常，多为化疗后引起），考虑患者肿瘤细胞耐药且预后不良，患者一般状态较差，血三系低下，输血效果不佳，单纯化疗达到CR可能性极小，且风险大。但是患者脾脏巨大、骨髓及全身多处淋巴瘤浸润，肿瘤负荷大，在CART细胞治疗过程中，会由于CART细胞大量增殖及杀伤大量肿瘤细胞产生致命性的细胞因子释放综合征（CRS），脾脏大量肿瘤细胞破坏可发生脾破裂出血危及患者生命；患者年龄大，白细胞较低，既往治疗时间较长，免疫功能低下，CART治疗杀伤异常及正常免疫细胞可进一步降低免疫功能产生严重感染；脏器功能较差，这些都是CART治疗风险，反复向患者及家属交代相关风险，因为无其它有效方法，患者及家属仍坚持行CART细胞治疗。

根据患者入院后骨髓肿瘤细胞的免疫表型，患者可供选择的CART细胞治疗靶点分别为CD19、CD22、CD20。根据既往经验，CD19-CART疗效最好，该患者的肿瘤细胞为CD19强阳性，故先选鼠源性CD19-CART治疗。

由于患者肿瘤负荷太高，采集血液淋巴细胞制备CD19-CART细胞后，予以对血液细胞计数影响小的化疗VLD(长春地辛1天、地塞米松30mg/天ⅹ4天、左旋门冬酰胺酶1万/天ⅹ2天)以降低肿瘤负荷。由于患者年龄大，心脏功能不好，故减少了预处理中的环磷酰胺(CTX)剂量，予以氟达拉滨(Flud)45mg/天ⅹ3天，CTX0.2ⅹ3天。此后回输CD19-CART细胞共1ⅹ/kg，由于肿瘤负荷大，担心过多的CART引起严重CRS故第一次先输注0.5ⅹ/kg,7天后未发现严重CRS再输注0.5ⅹ/kg。由于患者HBV-DNA载量高，免疫低下时病毒感染可能加重，故予以恩替卡韦加拉米夫定两种抗病毒药抗乙肝病毒治疗，并间断输注丙种球蛋白；同时给予抗生素防治感染。

第一次回输CART细胞后第六天查血白细胞介素-6[IL-6]62.66pg/mL↑、白细胞介素-10[IL-10].36pg/mL↑、干扰素-γ[IFN-γ]49.29pg/mL↑、可溶性CDpg/mL↑、肿瘤坏死因子-α[TNF-α]53.52pg/mL↑、总胆红素[TBIL]28.78umol/L↑、白蛋白[ALB]30.55g/L↓、直接胆红素[DBIL]9.90umol/L↑、总蛋白[TP]51.46g/L↓、间接胆红素[IBIL]18.88umol/L↑、前白蛋白[PA]46.40mg/L↓、白球比[A/G]1.46↓、钙[CA]1.87mmol/L↓、免疫五项结果示补体C4[C4]0.05g/L↓；第7天觉胸闷；第9天低热，最高37.6℃；第10天中度发热，最高体温38.1℃，服美林下降；第12天高热，最高为39.3℃，服美林体温下降；第13天查血IL-.04pg/mL↑、IL-.84pg/mL↑、IFN-γ.26pg/mL↑、可溶性CDpg/mL↑、TNF-α31.11pg/mL↑，予以地塞米松2mg后1天体温正常。

第一次CART细胞回输后浅表淋巴结、脾脏逐渐缩小（见下图），第15天骨穿形态及流式细胞免疫分析未检查出淋巴瘤细胞，染色体正常。细胞回输后24天，血PLT43×10^9/L、HGB92g/L↓、WBC1.04×10^9/L↓，脱离输注红细胞及血小板；第28天出院继续观察。

以上过程中，血HBV-DNA波动在-IU/ml，血转氨酶及胆红素持续在正常水平。

回输前后肿瘤影像变化如下：

出院后追踪，血三系细胞（红细胞、白细胞、血小板）在CART治疗后3个月恢复至正常水平，当地B超提示脾脏缩至正常，全身淋巴结正常。患者状态良好，多次外出旅游。多次催促患者返院行进一步治疗，患者拒绝返院。

三、复发再次入院

距第一次CART回输后近1年，患者于年10月患者再次发现颈部淋巴结肿大、腹胀，故于年10月29日再次入我院诊治。

1.入院检查

1）患者一般状态好，腹胀，ECOG评分1分，双侧颈部可扪及多枚肿大淋巴瘤，最大者直径2.5cm×2.0cm，无压痛，质地中等，边界不清，活动度差。脾脏肋下平脐，质韧、无触痛。

2）血常规三系低下，但无需输注红细胞及血小板；骨髓形态学查见异常淋巴细胞；流式细胞免疫分型示7.79%异常B淋巴细胞，表达CD19、CD22、CD20；染色体为复杂异常：75，XXX，+del（1）（q25），+del（3）（q21），-4，-5，+6，+10，+12，+16，-17，+20，+2mar，inc[cp3]/46，XX[20]；种血液肿瘤基因突变筛查示以下基因变异：TP53p.RQ、PRL10p.K39fs、TNFAIP3p.QX、DNMT3Ap.GV。血HBV-DNA：9.5×IU/ml。

3）影像检查：淋巴结超声示双侧颈部多发异常淋巴结，淋巴髓质结构消失，部分肿大、部分融合，呈串珠样，较大者位于颌下，右侧大者约2.6*0.9*2.0cm，左侧大者约1.2*0.5*0.7cm；右侧锁骨下淋巴结可见。腹部彩超结果示：脾肿大（肝脏弥漫性肿大，形态失常，长径超出测值范围，脾厚6.8，仰卧位脾脏下极平脐水平，周围脏器受压移位）。胸部CT示肺部感染。

2.第二次我院治疗经过：

由于第一次CD19-CART疗效好，副作用小，一次CART治疗完全缓解持续约1年，家属拒绝继续化疗，要求再次行CART细胞治疗，故考虑再次给以CART治疗。一般已经用过19-CART,再次19-CART疗效不如第一次好。CD22-CART的疗效不如CD20-CART。患者已经停用CD20单抗1年多，且淋巴瘤细胞表达CD20较强，故选择人源化CD20-CART治疗。

此次患者一般状况比第一次明显好，肿瘤负荷也不如第一次大，故直接予以FC（氟达拉滨45mgd1-3、环磷酰胺0.2gd1-3）联合地塞米松15mgq12hd1-3化疗方案预处理，年11月7日一次性回输CD20-CART细胞1.1×/kg，同时用抗生素治疗肺部感染，用两种抗病毒药控制乙肝病毒感染。回输CART细胞后第7天出现发热、最高体温39.7℃、伴轻微畏寒,予以美林后暂时下降，由于反复高热，于第8天给予地塞米松2mg后当天体温正常。

CD20CART细胞回输20天左右时，浅表淋巴结均未触及肿大，脾脏肋下未及；骨髓检查形态及流式细胞免疫分型未见淋巴瘤细胞，染色体正常；白细胞0.94×10^9/L↓、中性粒细胞计数0.19×10^9/L↓、血红蛋白94g/L↓、血小板34×10^9/L↓，患者出院。

四、第三次CART治疗

考虑第一次CART后11个月淋巴瘤复发，建议患者在CD20CART后序贯人源化CD22-CART治疗以预防复发,患者接受我们的意见，于CD20-CART后4月，来我院诊治。

入院检查

1）入院时复查血HGB正常，WBC及PLT低下，不需要输注。查体未查及异常。

2）骨髓形态学及流式细胞免疫分型未检查出淋巴瘤细胞。

3）影像学：B超：颈部可探及数枚淋巴结样回声，形态规则，髓质结构尚可分辨，右侧大小约0.89×0.40×0.58cm，左侧大小约0.71×0.27×0.50cm；腹部B超：脾脏肋下未及。

2.治疗

给予FC方案预处理后于年3月13日回输人源化CD22CART细胞1.7×/kg，治疗期间患者无明显CRS反应,出院前HBV-DNA定量为IU/ml。

五、随访

电话随访至年6月底，患者状态良好，正常生活，血WBC、HGB正常，PLT略低于正常水平。由于患者拒绝全身影像检查，难以判断是否CR，但是患者至少为明显好转生存。